L'un des principaux problèmes dans la détection de l'apoptose est que de nombreuses particularités du processus apoptotique et nécrotique se chevauchent. Par conséquent, il est souvent nécessaire d'utiliser plusieurs tests indépendants pour tirer des conclusions définitives. Chacun des tests actuellement utilisés a ses avantages et ses inconvénients qui le rend plus adapté pour certaines applications mais pas pour d'autres. Pour choisir les méthodes de détection appropriées pour votre système, vous devez connaître la cinétique de l'apoptose dans votre modèle parce que l'apoptose dans certains cas peut durée seulement 2-3 h de temps et pourrait être suivie par la mort des cellules nécrotiques.
Kits de Détection TUNEL (TdT-Mediated dUTP Nick-End Labeling): La fragmentation d'ADN est l’une des caractéristiques de l'apoptose. Il se produit dans les étapes ultérieures, généralement à la suite de l’activation de caspase. L’ADN fragmenté des cellules apoptotiques peut être marqué avec la biotine ou la FITC-dUTPs aux terminaux 3'-OH de l’ADN en utilisant la TDT (terminal deoxynucleotidyl transferase). Les cellules avec les ADN marqués peuvent ensuite être visualisées par microscopie optique ou quantifiés par cytométrie de flux. La méthode TUNEL est sensible et rapide, mais est soumise aux faux positifs provenant des cellules nécrotiques et des cellules en cours de division et de réparation d'ADN. Pour obtenir des résultats fiables l’essai TUNEL doit être jumelé avec un autre essai, par exemple, l’essai de détection d’annexine-V. La coloration TUNEL est généralement plus difficile dans les tissus paraffine-enfoncée en raison de la liaison transversale des protéines causés par des fixateurs. GenScript offre une gamme de Kits de Détection d’Apoptose TUNEL qui sont spécifiquement conçus pour détecter l'apoptose dans les sections de tissus congelés ou paraffine-enforcées et dans les cellules attachées, et utilise des nucléotides marqués à la biotine ou au FITC.
Kit d’Annexine V-EGFP: Les cellules apoptotiques sont connues pour afficher des molécules phosphatidylsérine (PS) sur leurs membranes externes, ce qui permet l’enlèvement sécurisé des débris apoptotiques sans activation des voies inflammatoires. Le timing de l’exposition des molécules PS peut dépendre de la nature de l’agent d’induction de l’apoptose. Les molécules PS peuvent être détectées en utilisant l’annexine V, une protéine liant les phospholipides Ca2+dépendante ayant une haute affinité pour la PS. Pour mieux distinguer entre les cellules apoptotiques et les cellules nécrotiques, GenScript utilise un deuxième colorant fluorescent, l'iodure de propidium (PI), qui n’entre que dans les cellules nécrotiques des membranes endommagées. L’essai d’annexine V de GenScript est non enzymatique, ne nécessite pas la fixation, et convient à la fois pour les cellules adhérents et les cellules de suspension. Il utilise l’annexine V fusionné avec l’EGFP pour détecter la PS par microscopie optique ou par cytométrie de flux.
Kits de Dosage de l’Activité de Caspase: Les caspases sont une famille de protéases à cystéine qui comprennent quelques-uns des principaux initiateurs et exécuteurs de l'apoptose. Ils existent au sein de la cellule comme pro-formes ou zymogènes inactives. Ces zymogènes sont clivés pour former des enzymes actives suivant l'induction de l'apoptose. Les inconvénients de cette méthode comprennent la nature transitoire de l’expression de la caspase et le fait que l’activation de caspase ne conduit nécessairement pas à l'apoptose. GenScript offre une gamme de Kits de dosage colorimétrique de Caspase pour le dosage de l'activité des caspases 2, 3, 6, 8 et 9 à l'aide d'un spectrophotomètre ou un lecteur de plaque de microtitrage.
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