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Au cours des vingt dernières années, la production des protéines recombinantes (protéines-r) est devenue de plus en plus utile en ce qui concerne les produits biopharmaceutiques avec des applications médicales, en particulier des protéines-r purifiées appropriées pour l'analyse de structure-fonction. La plupart des protéines-r appliquées à ce titre sont des molécules complexes qui doivent être modifiées post-translationnellement pour la conformation de plein bioactivité et la conformation native. À cet égard, des cellules mammifères cultivées produisent des protéines-r supérieurs parce qu'elles possèdent le bon mécanisme de repliement de protéines et de modification post-translationnelle. GenScript recommande son service d'expression en cellule mammifère dans les cas où le pliage des protéines est essentiel pour l'application du client et les cas dans lesquels le mécanisme interne de l’E.coli est incapable d'exprimer la protéine à temps et en qualité désirée. Notre équipe d'expression de protéine peut produire des protéines à l’échelle milligramme à partir des cellules mammifères en moins de quatre semaines. Les chercheurs peuvent ensuite suivre des pistes prometteuses dans les meilleurs délais.
Avantages de l’Expression en Cellule Mammifère:
- Capacité à exécuter des modifications post-traductionnelles spéciales et bon pliage
- Expression transitoire de protéine stable et rapide
- Puissant promoteur (CMV, SV40) de réglementions de l'expression des protéines
- Haut niveaux d'expression
- Production de protéines à grande échelle
Services Inclus:
I. Construction et Amélioration du Vecteur
- Pour l'expression stable ou transitoire, GenScript peut cloner l'ADNc chimère du client dans soit le vecteur d'expression mammifère du client, soit celle prévue par GenScript. Sur demande, GenScript ajoutera des signaux sécrétoires ou des tags à chaque vecteur d'expression pour faciliter un éventuel rétablissement de la protéine par chromatographie d'affinité. Pour les projets plus complexes, telles que celles nécessitant des modifications post-translationnelles, la formation des complexes multi métriques, la formation des ponts disulfure à l'intérieur ou entre des peptides, ou la glycosylation, GenScript recommande ses vecteurs habituels. Nous pouvons également étiqueter le gène désiré, le fragment de gène, ou la chimère de fusion avec un marqueur fluorescent, comme la GFP. En outre, nous pouvons générer et identifier des lignées cellulaires stables à haute productivité, pour l’extension d'échelle, la production de cGMP, ou les deux.
II. Expression stable du gène pour production à long terme
- L'ensemble du travail, la transfection, la sélection, et l'isolation des populations de cellule clonale, à l'évaluation des clones primaires pour la productivité et l'adaptabilité de croissance dans une culture en suspension sans sérum, offre la stabilité et l'évolutivité de production à long terme. Sur demande, GenScript appliquera l’amplification de gène en utilisant la méthotrexate, le clonage et la mise en banque. GenScript est aussi entièrement équipé pour exécuter des études sur la stabilité génétique et productive en présence et en absence de certains agents. GenScript offre la mise en banque des populations cellulaires en formes pré banque, banque de cellules mères, et banques de cellules de travail.
III. Expression transitoire du gène
- L’expression stable des gènes est réalisée à travers l'insertion du/des gène(s) recombinant(s) dans le génome hôte. Toutefois, l'identification et la caractérisation des lignées cellulaires recombinantes sont une opération coûteuse et de longue durée. Des approches plus rapides de production des protéines-r sont parfois préférées, en particulier pour les projets de sous-traitance ou d'optimisation des lignes de production à grande échelle. La production rapide de protéines (de milligrammes aux grammes) en utilisant l'expression transitoire du gène à partir des cellules mammifère est bien adapté à ce besoin. Contrairement à l'expression stable du gène, l'expression transitoire du gène implique la production des protéines-r à court terme, généralement pour pas plus de 10 jours de post-transfection, en l'absence de sélection génétique de l'ADN plasmidique. Notre expression transitoire de gène utilise des cellules adaptées à la suspension et peut facilement produire aussi peu que quelques millilitres ou autant que 100 litres. Les produits, qui sont composées des fluides de culture cellulaire ou de protéines récupérés, peuvent être livré au client quatre semaines après qu’un vecteur d'expression approprié a été construit. Sur demande, GenScript peut cloner le gène chimère du client dans des vecteurs de haute efficacité conçus spécifiquement pour le système d’expression transitoire du gène.
IV. Développement du processus et extension d'échelle
- GenScript peut optimiser les milieux de croissance et de production du système, offrant aussi une analyse approfondie sur le taux de croissance, le rapport de sous cultivation, la masse de cellules, et la productivité spécifique et volumétrique en utilisant des conditions valorisantes de productivité. En outre, un modèle de réduction d’échelle peut être appliqué pour prédire la performance des cellules. GenScript emploie un système propriétaire nouvel et très productive qui est caractérisé par un haut débit prédictif.
- Expression de protéines marquer aux 15N- ou 13C
V. Purification
- Après l’écoulement du temps d'expression, les cultures sont récoltées et le surnageant ou la fraction de cellule est collecté de l'installation pour la purification des protéines. La purification des protéines est généralement menée par la colonne d'affinité, mais d'autres colonnes, y compris la filtration sur gel, l’échange d'ions et la colonne hydrophobe sont également disponibles. Le tag de purification est enlevé par une protéase spécifique, et la protéine est ensuite purifiée par filtration sur gel.
- Expression de protéines marquer aux 15N- ou 13C
VI. Caractérisation de protéines
- À la fin de chaque projet, nos spécialistes confirment que le produit final répond aux spécifications exactes du client. En générale, cette évaluation comprend une partie ou la totalité des éléments suivants: le SDS ou le PAGE natif suivie par la coloration appropriée, la détermination de la concentration de protéine, le western blot, le spectre d’absorption, le séquençage du terminal-N, la spectrométrie de masse, la spectroscopie RMN, et les dosages d'activité.
Spécification de Service:
| Services | Description | Livraison |
| I. Génération du vecteur recombinant chimère |
- Amplification/isolation du gène ou gène synthétique d’intérêt dans un vecteur d’expression en cellule mammifère
- Vérification du gène sous cloné par qPCR et séquençage
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- Vecteur d’expression avec insère (5 ug)
- Fichier de séquence vérifié
- Stock glycérol avec vecteur
- Documentation des procédures
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| II.Expression transitoire de protéine |
- Transfection des cellules cibles (293, CHO) avec l’ADN recombinant chimère
- Expression transitoire de protéine
- Testage de l’expression de la protéine recombinante par western blot
- Etablissement des lignées cellulaires stables
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- Données d’expression
- Lignées cellulaires de l’expression transitoire ou stable de protéine
- Milieu conditionné
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| III. Expression de protéine à petite échelle |
- Analyse d’expression et optimisation pilote
- Génération de banque cellulaire
- Expression à petite échelle à partir de 1 à 5 litres
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- Boulette de cellule
- Données d’expression
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| IV. Production de protéine à grande échelle |
- Récolte de cellule
- Testage de l’expression par western blot
- Production à grande échelle de jusqu'à 100L
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| V. Purification et caractérisation des protéines |
- Purification de protéine par colonne d’affinité, échange d’ion, filtration sur gel, ou colonne hydrophobe
- Déménagement des tags
- Caractérisation par western blot, SDS-PAGE, ou séquençage
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- Protéines purifiées
- Données de CQ
- Documentation des procédures
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Devis et Commande:
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