Schéma 1:
Une protéine de fusion Trx a été immunoprécipité en utilisant l’anticorps monoclonal de souris anti-Trx (GenScript, A00180) lié à la résine de protéine G (GenScript, L00209).La protéine de fusion Trx a ensuite été immuno taché avec le même anticorps primaire en utilisant l’IgG de chèvre anti-souris HRP conjugué (Fc specific, Sigma, A 0168) (Voie 1) et en utilisant le Kit ONE-HOUR IP-Western L00232 (Voie 2).
L’
immunoprécipitation (IP)
est une technique courante utilisée pour l'identification des interactions protéine à protéine. L’IP est généralement réalisée à l'aide d'un anticorps primaires avec une résine d’anticorps secondaire ou une résine de protéine A ou G. Après l’immunoprécipitation, un Western blot est utilisé pour détecter d'éventuelles protéines associées à la protéine cible.
Cependant, un problème du IP Western blot est que l'image est toujours contaminés par des chaînes lourdes, des chaînes légères ou des protéines A ou G de la résine. Cela rend les protéines plus difficiles à identifier.
Un produit novateur de GenScript, le Kit ONE-HOUR
TM IP-Western, supprime complètement cet obstacle. Avec ce kit, l'utilisateur peut utiliser des protéines A, G, A/G ou tout résine d’anticorps secondaire avec AUCUNE contamination que ce soit de chaînes lourdes, de chaînes légères ou de protéines A ou G.
- GenScript a développé une solution de blocage (Solution de prétraitement) qui se lie sélectivement et bloque à la fois les chaînes lourdes et légères des anticorps primaires et des protéines A et G utilisés pour l’immunoprécipitation, empêchant la réactivité croisée entre:
1) L'anticorps secondaire du western blot ultérieure et l’anticorps primaire utilisés pour l’immunoprécipitation, et
2) L’anticorps primaire ou secondaire du western blot ultérieure et les protéines A et/ou G, utilisé pour l’immunoprécipitation.
- La solution de blocage est formulée pour lier et bloquer le blot avec une efficacité considérablement améliorée. Ceci réduit le temps de blocage à seulement cinq minutes.
- La technologie ONE-HOUR IP-Western intègre l’étape de liaison de l’anticorps secondaire, et ne nécessite pas d'anticorps secondaire.
- La technologie ONE-HOUR IP-Western simplifie et réduit toute la procédure du IP-Western blot à seulement une heure.
Le Kit ONE-HOURTM IP-Western contient tous les réactifs, tampons, membrane nitrocellulose et substrat HRP nécessaires pour l'exercice d'un IP-Western blot. Après le transfert de protéines du gel à la membrane, l'utilisateur incube la membrane dans la Solution de Prétraitement pour cinq minutes, suivi par l'incubation dans la solution WB (préparé à partir de l'anticorps primaire, l’IP-WB 1, l’IP-WB 2 et l’IP-WB 3) pour 40 minutes. Ensuite, la membrane est lavée trois fois cinq minutes chacune. La tache peut être développée en utilisant le substrat HRP inclus dans le kit. Le résultat du ONE-HOUR IP-Western blot est comparé avec le résultat d’un western classique dans le
Schéma 1.
Le Kit ONE-HOURTM IP-Western Complet, y compris L00231 (pour l’anticorps primaire de lapin), L00232 (pour l’anticorps primaire de souris) et L00233 (pour l’anticorps primaire de chèvre) combinent une haute sensibilité et un faible background. Ils détectent des nano grammes de l'antigène désiré tout en laissant inaperçus des quantités d'anticorps plus élevé que 2 μg par voie. Le bloquant A&G inclus dans le kit prend cinq minutes pour l'utilisation et donne des résultats propre de l’IP-Western, même avec des contaminations rémanentes graves dû aux Protéines A, G ou A/G. Pour le kit L00231 (anticorps primaire de lapin), le Bloquant de la protéine G est simplement ajoutée à la solution IP-WB 3. La protéine A rémanente ne porte pas atteinte aux résultats du Western.
Applications
Le Kit ONE-HOUR
TM IP-Western permet un Western blot rapide pour la détection des protéines de l’immunoprécipitation en utilisant:
- La Résine de Protéine A, G, ou A/G
- N’importe quelle Résine d’anticorps secondaire
