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rnai technology

sirna service quotationTechnologie ARNi
( RNAi Technology)

L’ARN interférence (ARNi) est un mécanisme naturel. Il s’agit d’un processus qui dégrade les ARN messagers de séquence homologue à celle de l'ARN interférents (siARN) et inhibe l’expression de gènes cibles. Il fournit une excellente plate-forme technologique aux études de l'expression et de la fonction de gènes dans des différents modèles, y compris, la drosophile, C. elegans et des systèmes de cellule mammifère. L’ARNi permet aux chercheurs d’inhiber complètement ou partiellement l'expression d'un gène spécifique et aboutir aux effets de knockout et knockdown des gènes cibles.

Les petits ARN interférents (siARN) sont des courts fragments d’ARN dont la longueur est de 19 à 22 nucléotides. Ces siARN sont générés via le clivage des dsARN par l‘enzyme DICER, une ribonucléase de la famille de la RNase III. Ils sont alors incorporés dans un complexe RISC (RNA-induced silencing complexe) et dénoués en siARN simple brin. Ensuite, le siARN simple brin guide le complexe RISC à l'ARNm cible pour le détruire et provoquer l'interférence d'ARN. Selon la quantité de siRNA exprimé et son efficacité inhibitrice, l'expression du gène cible peut être complètement bloquée ou réprimée mesurablement. Cela permet aux chercheurs de déterminer et étudier la fonction de gènes, particulièrement les gènes qui sont létales en cas de knockout complet. Le vecteur Tet-on et des autres vecteurs inductibles pour l’expression des siARN de GenScript fournissent des ARNi contrôlés au degré parfait qui est nécessaire pour les expériences délicates.

  • siARN
  • siARN In vivo
  • miARN
  • Collection de Publications
 

La technologie siARN basé sur vecteur de GenScript est une adaptation de sa technologie de synthèse de gènes dans le domaine de l'ARN interférence (ARNi), comme un outil puissant pour l'analyse de la fonction des gènes et la validation des cibles des médicaments. Le service siARN de Genscript comprend la conception de siARN, les vecteurs de siARN et les constructions de siARN à façon. Par rapport aux siARN synthétiques, la technologie siARN de Genscript ont des avantages suivants :

  • Il produit des constructions de siARN extrêmement fiables au prix le moins cher.
  • Ses produits sont plus stables et durent plus longtemps.
  • Il libère les scientifiques de la tâche longue et difficile à la construction des vecteurs de siARN

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Technologie siARN basé sur Vecteur :

Les petites molécules siARN peuvent être préparées soit par des méthodes d’ARNi traditionnelles, qui utilisent l’ARN synthétique en duplex se composant de deux molécules (21 oligonucléotide) non modifiées et recuites ensemble; soit par la transcription, qui est effectuée par les promoteurs de l'ARN polymérase. Les deux facteurs les plus critiques dans la détermination de l'efficacité des expériences de l’ARNi sont la capacité de l’inhibition de la séquence de siARN pour la cible spécifique d'ARNm, et l’efficience de la transfection des constructions de siARN et des vecteurs d’expression.

La transfection directe des cellules par le duplex de siARN synthétique chimiquement, qui est initialement démontrée par Tuschl Lab de l'Université Rockefeller, est actuellement le plus populaire approche. Toutefois, le succès de cette technique dépend fortement de la capacité du système de cellule modèle qui subit la transfection et soutient l’effet de l’ARNi. En outre, la présence discontinue de siARN dans la cellule rend cette technique moins réalisable pour les études à long terme. Ce problème, comme beaucoup d'autres inconvénients de la transfection directe de siARN, est complètement résolu en cas de siARN basé sur vecteur d'ADN.

La technologie siARN basé sur vecteur d'ADN, par contre, clone un petit insert d'ADN d'environ 70 pb dans un vecteur commercialement disponible ou personnalisé. Ce vecteur peut être transfectées dans la cellule, où l'insert d’ADN peut exprimer d'un ARN court en épingle à cheveux. Cette épingle à cheveux d'ARN est rapidement générée par la machinerie cellulaire en siARN double-brins. L'utilisation de plasmide permet aux chercheurs de profiter de nos promoteurs inductibles extrêmement fiables.
 

Il existe plusieurs façons d'inciter l'ARNi dans un hôte vivant, mais seulement trois d'entre eux ont constamment montré eux-mêmes leur efficace in vivo : La première, c’est la livraison directe de la construction de siARN actif dans le tissu d'animal ; la deuxième, c’est la livraison d'ARN court en épingle de chevaux (shARN pour Small Interfering ARN) par les vecteurs viraux (Ces shARN sont rapidement transformés en siARN actifs dans la cellule); et la dernière, c’est la livraison d'ARN par les vecteurs plasmidiques. Ces méthodes ont étendu l'applicabilité de la technologie siARN dans le domaine de thérapie à base de virus et dans les expériences de fonction génique in vivo [1]. GenScript est fier d'offrir les vecteurs adénoviraux, lentiviraux et rétroviraux, et une sélection des vecteurs plasmidiques à siARN.

Création des souris knock-out en utilisant les siARN transgéniques :

La génération des lignées de souris knock-out, en utilisant des techniques conventionnelles, peut être extrêmement coûteuse en temps et en coût. En outre, avec cette méthode, de nombreux gènes d'intérêt ne peuvent pas être complètement inhibés sans tuer la souris. Par contre, les gènes même difficiles à manipuler peuvent être inhibés partiellement ou complètement dans les souris vivantes en utilisant siARN transgéniques [2]:
  1. Conserver plusieurs constructions de siARN basé sur vecteur.
  2. Évaluer les siARN basés sur vecteur dans des lignes de cellules comme HEK293 pour confirmer qu'ils régulent négativement l'expression du gène d'intérêt.
  3. Les siARN basé sur vecteur sont transformés en forme linéaire et transfectés dans des cellules souches embryonnaires (ES) par l’électroporation. Ces cellules ES peuvent être choisis via la résistance aux médicaments.
  4. Générer la ligne de souris transgéniques à l'aide des lignées de cellules ES résistantes aux médicaments.

Avantages de siARN transgéniques par rapport aux technologies knock-out conventionnelles :

  • Le siARN transgénique est une approche rapide et coût-efficace à la génération de souris knock-out. Le temps et les frais à construire des constructions de siARN, qui sont trois semaines et $375 par construction, sont seulement une fraction de ceux des méthodes conventionnelles, qui sont normalement trois mois et au moins $8000.
  • Le siARN transgénique n’exige pas de séquençage génomique, qui est essentiel pour la technologie knock-out conventionnelle.
  • Le siARN transgénique peut produire des phénotypes knock-out partielle et complète. Cela permet d’étudier des gènes difficiles à manipuler et nécessaires à vivre

Injection de siARN dans les animaux par d'autres méthodes :

  • Les siARN basés sur vecteur en forme plasmide peut être directement injecté dans certains organes [3].
  • Injection veineuse à la queue : Les siARN basés sur vecteur peuvent être injecté dans les animaux différents en utilisant l’injection veineuse hydrodynamique à la queue [4].
  • Forme liposomale: Les siARN basés sur vecteur peuvent être formulées en liposomes cationiques et entrer dans les animaux par injection intraveineuse [5].

Références :

  1. Haibin Xia, Qinwen Mao, Henry L. Paulson, Beverly L. Davidson. siRNA-mediated gene silencing in vitro and in vivo. Nat Biotechnol. 2002 Oct; 20 (10): 1006-1010.
  2. Kunath T, Gish G, Lickert H, Jones N, Pawson T, Rossant J. Transgenic RNA interference in ES cell-derived embryos recapitulates a genetic null phenotype. Nat Biotechnol. 2003 May; 21 (5): 559-561.
  3. Giladi H, Ketzinel-Gilad M, Rivkin L, Felig Y, Nussbaum O, Galun E. Small interfering RNA inhibits hepatitis B virus replication in mice. Mol Ther. 2003 Nov; 8 (5): 769-776.
  4. Gratsch TE, De Boer LS, O'Shea KS. RNA inhibition of BMP-4 gene expression in postimplantation mouse embryos. Genesis. 2003 Sep; 37 (1): 12-17.
  5. Sorensen DR, Leirdal M, Sioud M. Gene silencing by systemic delivery of synthetic siRNAs in adult mice. J Mol Biol. 2003 Apr 4; 327 (4): 761-766.
 

Les miARN, sont difficiles à isoler, en raison de leur faible abondance. Une fois ils sont isolé, ces ARN 18-24nt doivent être purifié et liés à la séquence d’adaptateur de 5' et 3. Après une étape de RT-PCR, ils sont clonés dans les vecteurs et séquencés. Pour remplacer tout cela, l'analyse informatique des séquences génomiques est souvent utilisée comme un outil valable qui complète le clonage. Les nouveaux miARN sont identifiés dans cette manière. Chez GenScript, nous vous proposons un autre moyen de cloner vos séquences d’intérêt avec notre technologie miARN basé sur vecteur. Pour supplémenter nos constructions siARN et notre série de vecteurs de siARN, nous avons lancé un service de construction de miARN dans le vecteur de votre choix. Nous pouvons vous aider à la construction de la séquence de gène que vous avez choisi et nous a fourni, qui peut ensuite être cloné dans un de nos vecteurs à cloner de miARN. Le plasmide exprimant miARN est purifié et prête à transfecter. Il peut être utilisé pour une variété d'applications, telles que la quantification à l'aide du Northern blot, la dot blot, l’essai de protection de RNase, l'analyse d'extension d’amorce, l'essai d'envahisseur et PCR quantitatif.

 miRNA

Technologies miARN

L'augmentation de l'évidence indique que les miARN régulent des voies complexes et divers, qu’il s’agit de la prolifération de cellule, la mort de cellule, le développement précoce, l’apoptose, la différentiation de cellule, le métabolisme de gras, le cancer, le développement neurologique et la maladie virale. Un seul miARN peut concerner des multiples voies impliquant la régulation de plusieurs gènes. Inversement, plusieurs miARN peuvent aussi coopérer le contrôle d’une seule cible de miARN. Cela cause la complexité de contrôle traductionnel de quelques gènes et le réseau remarquablement complexe qui régule de nombreux aspects de la fonction des cellules eucaryotes. Au moins 2 études indépendantes ont prédit que 20-30 % des gènes humains pourrait être contrôlé par les miARN.

Les miARN sont encodés dans des lieux autres que leurs cibles. Une majorité (environ 70 %) des gènes miARN des mammifères sont trouvés dans les unités de transcription définies. Ils sont transcrits par l'ARN polymérase II et leur activation implique dans un processus en plusieurs étapes. Normalement, ces miARN régulent l'expression des gènes en se liant aux sites de liaison imparfaitement correspondus dans le 3'-régions non traduites de l'ARNm cible. Ils sont exprimés comme des molécules en épingle plus longues et générés par l’enzyme DICER en une façon similaire que siARN et peuvent associer avec RISC dans les cellules. Leur grandeur est identique d’environ 22 nt. Ces peptits ARN d'environ 22nt donc induire la dégradation d'ARNm ou la repression de traduction ou tous les deux. La compréhension de miARN nous permettra d'ouvrir une nouvelle fenêtre pour le diagnostic et le traitement de nombreuses maladies humaines.

Applications :
  • Le clonage de miARN cible et l'évaluation de la régulation de miARN
  • Le ciblage putatif des séquences cibles de miARN
  • L'expression de miARN peuvent utiliser à découvrir l'expression différentielle de miARN à travers les tissus et les états de maladie
 

Sélection de Publications Citant la technologie siARN de GenScript :

  1. Jyoti Sinha, Frank Chen, Tamir Miloh, Robert C Burns, Zhisheng Yu, and Benjamin L Shneider. beta-KLOTHO AND FGF 15/19 INHIBIT THE APICAL SODIUM DEPENDENT BILE ACID TRANSPORTER IN ENTEROCYTES AND CHOLANGIOCYTES. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. Sep 2008


  2. Rosendo Estrada, Qun Zeng, Hongwei Lu, Harshini Sarojini, Jen-Fu Lee, Steven P. Mathis, Teresa Sanchez, Eugenia Wang, Christopher D. Kontos, Chen-Yon Lin, Timothy Hla, Bodduluri Haribabu, and Menq-Jer Lee. Up-regulating sphingosine-1-phosphate receptor-2 signaling impairs chemotactic, wound-healing, and morphogenetic responses in senescent endothelial cells. J. Biol. Chem. Sep 2008


  3. Xiuxin Liu, Kazue Hashimoto-Torii, Masaaki Torii, Tarik F. Haydar, and Pasko Rakic. The role of ATP signaling in the migration of intermediate neuronal progenitors to the neocortical subventricular zone. PNAS. Aug 2008; 105(33): 11802 - 11807


  4. Joshua Arnold, Bevin Zimmerman, Min Li, Michael D Lairmore, and Patrick L Green. Human T-cell Leukemia Virus Type-1 Antisense-encoded Gene, Hbz, Promotes T Lymphocyte Proliferation. Blood. Aug 2008


  5. Sarah Hummasti and Peter Tontonoz. HRASLS3 is a PPARγ-selective target gene that promotes adipocyte differentiation J. Lipid Res. Jul 2008


  6. Sailesh Surapureddi, Ritu Rana, Janardan K Reddy, and Joyce A Goldstein. Nuclear Receptor Coactivator 6 Mediates the Synergistic Activation of Human Cytochrome P-450 2C9 by the Constitutive Androstane Receptor and Hepatic Nuclear Factor-4α. Mol. Pharmacol. Sep 2008; 74(3): 913 - 923


  7. Liling Yang, Shuxing Wang, Backil Sung, Grewo Lim, and Jianren Mao. Morphine induces ubiquitin-proteasome activity and glutamate transporter degradation. J. Biol. Chem. Aug 2008; 283(31): 21703 - 21713


  8. KangAe Lee, Jeremy D. Lynd, Sandra O'Reilly, Matti Kiupel, J. Justin McCormick, and John J. LaPres. The Biphasic Role of the Hypoxia-Inducible Factor Prolyl-4-Hydroxylase, PHD2, in Modulating Tumor-Forming Potential. Mol. Cancer Res. May 2008; 6(5): 829 - 842

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